A extração de ácidos nucleicos é a primeira etapa do protocolo de preparação de amostras do NGS. Os ácidos nucleicos são grandes biomoléculas essenciais a todas as formas de vida conhecidas. São compostos por nucleotídeos, que são monômeros compostos por três componentes: um açúcar, um fosfato e uma base nitrogenada. As duas principais classes de ácidos nucleicos são DNA e RNA. O açúcar do RNA é a ribose, enquanto o açúcar do DNA é a desoxirribose.
Um diagrama mostrando a estrutura do RNA (à esquerda) e do DNA (à direita). A uracila é a base pareada com a adenina no RNA, enquanto a timina é pareada com a adenina no DNA. Crédito da imagem: Wikipédia
Tipos de extração de ácido nucleico
Extração de Tiocianato de Guanidínio-Fenol-Clorofórmio
Após a ruptura da estrutura celular do ácido nucleico, a DNase e a RNase são utilizadas para inativar as nucleases celulares. Os ácidos nucleicos desejados podem então ser separados dos restos celulares.
O fenol por si só é um ácido carbólico inflamável, corrosivo e tóxico. Mas uma mistura de fenol, clorofórmio e uma pequena quantidade de isoamil pode ser usada para extrair DNA. Quando fenol e clorofórmio são adicionados à amostra, forma-se uma emulsão contendo uma camada de DNA na parte superior, devido à sua natureza hidrofílica. O DNA pode então ser coletado e precipitado por centrifugação. O pellet de DNA resultante pode então ser dissolvido em água estéril.
Um diagrama mostrando as etapas de extração com fenol-clorofórmio: adição da mistura de fenol-clorofórmio ao lisado celular, centrifugação e, em seguida, lavagem com água para obter o DNA isolado. Crédito da imagem: Eva Meszaros, 2021
A técnica de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio pode então ser usada para extrair RNA em uma única etapa. O RNA é separado do DNA após a extração usando uma solução ácida composta de tiocianato de guanidínio, acetato de sódio, fenol e clorofórmio. A recuperação do RNA é feita por precipitação com isopropanol – isso cria uma condição ácida na qual o RNA permanece na superfície da mistura.
Centrifugação em gradiente de cloreto de césio/brometo de etídio
A centrifugação em gradiente de cloreto de césio/brometo de etídio tem sido usada em laboratórios de pesquisa desde 1950. O método explora as diferentes densidades entre os íons de césio e a água, juntamente com a intercalação de brometo de etídio para interferir na replicação, transcrição, reparo e recombinação do DNA.
Esta centrifugação em gradiente é um método complicado, caro e demorado em comparação com outros protocolos de isolamento. Requer uma grande quantidade de amostra e, portanto, não é adequada para todos os tipos de sequenciamento. Além disso, o brometo de etídio é prejudicial. Portanto, este método não é utilizado em laboratórios clínicos devido às suas limitações.
Extração em Fase Sólida
A purificação nucleica em fase sólida pode ser encontrada na maioria dos kits de extração comerciais disponíveis no mercado atualmente. Normalmente, é realizada utilizando uma coluna de centrifugação operada sob força centrífuga, permitindo que o DNA seja purificado de forma rápida e eficiente. A coluna deve primeiro ser condicionada para absorção da amostra, o que pode ser feito utilizando um tampão a um determinado pH. Após a ruptura das células, os ácidos nucleicos desejados são absorvidos pela coluna devido ao pH da solução de ligação. Os contaminantes são então removidos por lavagem com um agente competitivo, e água é introduzida para liberar os ácidos nucleicos desejados da coluna.
Purificação baseada em esferas magnéticas
A separação magnética é atualmente considerada um método simples e eficiente para a purificação de ácidos nucleicos. Trata-se de uma modificação da extração em fase sólida. As esferas têm carga superficial negativa e ligam-se seletivamente a proteínas, como o DNA. O processo de ligação pode, às vezes, ser auxiliado pela aplicação de um ímã na lateral do tubo, agregando as partículas próximas à parede. O restante da amostra, composto por detritos celulares e material indesejado, pode então ser descartado. Os ácidos nucleicos são removidos das partículas magnéticas com um tampão e quaisquer contaminantes restantes são removidos por lavagem.
Um diagrama mostrando o protocolo de purificação baseado em esferas magnéticas. Crédito da imagem: Andrew Gane, 2019
Este método certamente apresenta vantagens: dispensa centrifugação, filtração a vácuo ou separação em coluna repetidas, o que o torna eficiente em termos de tempo e custo. Diversos kits comerciais estão disponíveis, com alguns fabricantes até mesmo combinando esferas magnéticas com outras técnicas de extração em fase sólida, incluindo o uso de sílica. Essas tecnologias estão auxiliando os cientistas ao aprimorar a recuperação de DNA com apenas pequenos volumes de amostra.
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